探究宿主-病原體相互作用特點(diǎn)是研究微生物與免疫學(xué)方向?qū)W科的重要方法。宿主細(xì)胞吞噬病原體后其表征將會(huì)改變，多數(shù)研究主要利用宿主細(xì)胞或者細(xì)胞系在體外實(shí)現(xiàn)，說(shuō)明RNA的表達(dá)或細(xì)胞培養(yǎng)中回收的蛋白質(zhì)的情況。實(shí)驗(yàn)條件下，所有的宿主細(xì)胞擁有相同數(shù)量病原體具有合理性。然而，利用吞噬細(xì)胞的病原體吸收是不同步的。所以，包含了不同數(shù)量病原體的宿主細(xì)胞導(dǎo)致不同致病菌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)生物合成。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記分析方法檢測(cè)與宿主細(xì)胞相關(guān)的病原體的數(shù)量。結(jié)合多marker染色，分析宿主細(xì)胞種群的感染情況和寄生負(fù)荷結(jié)果（相關(guān)宿主細(xì)胞的表型）。隨著單克隆抗體和熒光標(biāo)記試劑的產(chǎn)生，宿主細(xì)胞在進(jìn)程中的變異研究增多。

事實(shí)上，已有實(shí)驗(yàn)利用多通道流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微技術(shù)來(lái)檢測(cè)寄生蟲(chóng)與宿主細(xì)胞關(guān)系，但兩種方法均有不足。流式細(xì)胞分析術(shù)（FACS）能夠檢測(cè)擁有寄生蟲(chóng)的宿主細(xì)胞的表型，但不能精確到單細(xì)胞中寄生蟲(chóng)的數(shù)量且不能做到細(xì)胞原位的定位。熒光顯微技術(shù)的準(zhǔn)確性更高，原位表面marker的表達(dá)情況能夠篩選擁有寄生蟲(chóng)的宿主細(xì)胞。但是，宿主細(xì)胞寄生負(fù)荷marker強(qiáng)度的高度客觀仍然存在困難。

因此，一種能夠?qū)渭?xì)胞定量和宿主細(xì)胞表型分析相結(jié)合的技術(shù)是十分必要的。

實(shí)驗(yàn)方法

利用TissueQuest和StrataQuest軟件同時(shí)滿足單細(xì)胞定量分析和宿主細(xì)胞表型分析。以Dot-Finder運(yùn)算法為核心的全景組織細(xì)胞定量分析技術(shù)，分析感染了L.major的原位及體外巨噬細(xì)胞。

與流式細(xì)胞術(shù)（FACS）相比，熒光標(biāo)記marker的強(qiáng)度能夠在原位單細(xì)胞級(jí)別定量且不需要制備細(xì)胞懸浮液。TissueQuest軟件能夠?qū)崿F(xiàn)從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確反向回溯到影像中的細(xì)胞。反向回溯的特征可以用來(lái)檢測(cè)原位細(xì)胞亞群，設(shè)門的細(xì)胞定位(DAPI，AF546（CD11b）和Cy5(F4/80)。通過(guò)調(diào)節(jié)核的尺寸，面積和灰度值完成軟件分析。反向回溯實(shí)時(shí)觀察創(chuàng)建的陽(yáng)性細(xì)胞散點(diǎn)圖。根據(jù)細(xì)胞尺寸和染色強(qiáng)度確定cut-off值。檢測(cè)DAPI的陽(yáng)性值和細(xì)胞中活性L.major，利用ring mask功能創(chuàng)建DAPI通道。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

淋巴腺體部分的胞內(nèi)病原體檢測(cè)

細(xì)胞核識(shí)別和ring mask計(jì)算

單通道影像獲取，利用四通道進(jìn)行熒光檢(DAPI,FITC,Rhodamin,Cy5),每個(gè)影像包含將近50-200個(gè)細(xì)胞，并且掃描部分圖像自動(dòng)拼接。每個(gè)熒光通道的影像和多個(gè)FOV都能夠被自動(dòng)獲取，收集和后期的組合。(A) 利用參數(shù)調(diào)節(jié)識(shí)別細(xì)胞核(B) 創(chuàng)建ring mask (C) ring mask中黃色高亮部分為自動(dòng)篩選ROI中病原體

Ring mask中的L.major病原體識(shí)別

根據(jù)活性病原體的微弱信號(hào)和復(fù)雜的背景信息識(shí)別病原體

Parasite finder預(yù)設(shè)程序可根據(jù)用戶需要選擇方法最高程度的區(qū)別背景與待分析部分。

(A) ring mask胞質(zhì)部分，代表缺少病原體培養(yǎng)的條件下的巨噬細(xì)胞。(B) 藍(lán)色部分為感染的巨噬細(xì)胞的ring mask,黃色箭頭標(biāo)出DAPI的陽(yáng)性信號(hào)。(C) 黃色部分微弱信號(hào)區(qū)分未感染的巨噬細(xì)胞的ring mask中的偽信號(hào)。（D）創(chuàng)建偽陽(yáng)性信號(hào)。多于30個(gè)病原體的巨噬細(xì)胞被標(biāo)出。（E）檢測(cè)微弱信號(hào)區(qū)分沒(méi)有被感染的巨噬細(xì)胞的ring mask中的非偽信號(hào)。（F）所有被感染的巨噬細(xì)胞（黃色部分和黃色箭頭）均被識(shí)別出。

感染的巨噬細(xì)胞病原體密度和感染比例

（A）軟件自動(dòng)計(jì)算感染與未感染的巨噬細(xì)胞。（B）每個(gè)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)寄生蟲(chóng)的平均數(shù)量的定量分析。在分析了237個(gè)與8639個(gè)細(xì)胞后，得出隨即選擇的樣本足以證明總感染比例的正確性。（C）胞內(nèi)寄生蟲(chóng)與巨噬細(xì)胞的關(guān)系。胞內(nèi)病原體的數(shù)量和Y軸相應(yīng)的病原體對(duì)應(yīng)的巨噬細(xì)胞擁有病原體的數(shù)量區(qū)間。

此圖闡明巨噬細(xì)胞中的活病原體的高度混雜性。推測(cè)原因?yàn)槎鄻踊耐淌勺饔煤筒≡w繁殖的加強(qiáng)。巨噬細(xì)胞的表型決定胞內(nèi)病原體擴(kuò)張存在可能性。

感染與未感染的原位巨噬細(xì)胞定量分析骨髓細(xì)胞marker表達(dá)

(A) 直方圖表示X軸巨噬細(xì)胞擁有病原體與Y軸病原體的數(shù)量。分析得到細(xì)胞核，ring mask，ring mask中的病原體，ring mask中的CD11b或者F4/80的強(qiáng)度表達(dá)(B) 擁有不同數(shù)量病原體的巨噬細(xì)胞的平均強(qiáng)度分析。估算每個(gè)成核原位宿主細(xì)胞。

體外原位成活與失活胞內(nèi)病原體的診斷

體外活細(xì)胞和死細(xì)胞的定量分析

失活病原體不能夠標(biāo)記DAPI，所以軟件能夠識(shí)別宿主細(xì)胞中不同的病原體。對(duì)樣本進(jìn)行EB-AO平行染色。StrataQuest識(shí)別細(xì)胞的胞質(zhì)（綠色），細(xì)胞與細(xì)胞接觸部分（橘色）。

(A) AO灰階圖用于薄膜的檢測(cè)（綠色），細(xì)胞邊緣的確定（橘色）。(B) 對(duì)粘連細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)分析。(C) 反向回溯確定巨噬細(xì)胞擁有多于2個(gè)失活寄生蟲(chóng)。(E) 擁有失活寄生蟲(chóng)的巨噬細(xì)胞的頻率分析。（F）擁有不同數(shù)量失活寄生蟲(chóng)的吞噬細(xì)胞的頻率分析。

此圖為寄生負(fù)載的評(píng)估。(A) 被感染的淋巴腺, 灰階圖為DAPI+宿主細(xì)胞核和寄生蟲(chóng)DNA。(B) 胞核，胞漿和寄生蟲(chóng)的重疊影像(C)(D) 反向回溯擁有3和5-10寄生蟲(chóng)的細(xì)胞(E)感染細(xì)胞的寄生負(fù)載。

DAPI的信號(hào)識(shí)別病原體的DNA并未退化，活檢，干燥前的病原體仍然具有活性。識(shí)別胞核（橘色）和核膜（綠色）。DAPI陽(yáng)性病原能夠在宿主細(xì)胞的胞漿部分進(jìn)行識(shí)別。

后續(xù)研究中會(huì)在宿主-寄生蟲(chóng)的聯(lián)系的分子反應(yīng)機(jī)理，微生物方向疾病治愈做出提高。